Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài KH&CN cấp Bộ mã số B2016-TNA-24 do TS. Hoàng Thị Thu Yến - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên chủ nhiệm

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

• Tên đề tài: Nghiên cứu tạo thư viện cDNA/EST, giải mã và phân tích sự biểu hiện các gen liên quan đến quá trình tổng hợp polyphenol ở chè trồng tại Thái Nguyên
• ­Mã số: B2016-TNA-24
• Chủ nhiệm: TS. Hoàng Thị Thu Yến
• Cơ quan chủ trì: Đại học Thái Nguyên
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2016-06/2018

2. Mục tiêu

Nghiên cứu xây dựng thư viện cDNA/EST, tạo dòng, biểu gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp polyphenol, định lượng một số hợp chất polyphenol từ lá chè nhằm làm sáng tỏ sự biểu hiện của các gen ở chè và góp phần nghiên cứu ứng dụng các hợp chất quan trọng của chè.

3. Tính mới và sáng tạo

Nhóm nghiên cứu là những người đầu tiên ở Việt Nam tiến hành thực hiện xây dựng thư viện cDNA/EST, nghiên cứu mô tả cấu trúc, chức năng và định lượng sự biểu hiện một số gen tham gia con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè Trung Du bản địa của Thái Nguyên.

4. Kết quả

1. Đã định lượng được 5 hợp chất catechins (C, GC, ECG, EGC, và EGCG) từ 8 mẫu chè nghiên cứu, trong đó mẫu chè Indo có hàm lượng catechin tổng và catechin thành phần vượt trội, các mẫu chè Keo Am Tích, Khúc Vân Tiên và Trung Du Xanh có hàm lượng tương đương nhau. Mẫu chè pH1 có hàm lượng catechin tổng thấp nhất.
2. Định lượng được sự biểu hiện của gen FLS liên quan đến tổng hợp flavonol; gen LAR và ANR liên quan đến tổng hợp catechins ở 2 mẫu chè Trung Du Xanh và Trung Du Tím. Gen FLS, ANR và LAR có mức độ biểu hiện cao hơn ở chè Trung Du Xanh.
3. Đã nghiên cứu tạo thư viện cDNA/EST từ 3 mẫu chè: Trung Du Xanh, Trung Du Tím và Phúc Vân Tiên được. Kết quả thu được 554 dòng cDNA/EST, 158 plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST có kích thước ≥ 200bp. Đã giải trình tự 92 dòng và thu được tổng số 18 trình tự protein tương đồng và 11 trình tự chưa xác định tên trên Genbank.
4. Đã tạo dòng và phân tích trình tự gen FLS từ chè Trung Du Xanh và chè Trung Du Tím. Gen FLS thu được có chiều dài 996 bp, mã hóa 331 amino acid. Amino acid của FLS của 2 mẫu chè nghiên cứu có hệ số tương đồng 97,9%. Gen CsANR2 và CsLAR1 được phân lập từ chè Trung Du Xanh. Gen CsANR2 có chiều dài 1,014 kb, mã hóa 337 amino acid. Gen CsLAR1 có kích thước 1,029 kb, mã hóa 342 amino acid. Kết quả so sánh chỉ ra không có sự biến đổi trình tự amino acid ở các domain chức năng quan trọng của CsANR2, trong khí đó CsFLS và CsLAR1 có một vài sự sai khác amino acid ở domain và motif chức năng so với trình tự công bố trên Genbank.
5. Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a(+) mang gen FLS, CsANR2 và CsLAR1 phân lập từ chè Trung Du Xanh. Biểu hiện được được FLS và CsLAR1 tái tổ hợp ở vi khuẩn E.coli chủng Rosetta. Trong đó, CsLAR1 có biểu hiện hoạt tính sinh học.

5. Sản phẩm

- Sản phẩm khoa học: 05 bài báo được xuất bản, 01 bài báo đã đăng ở tạp chí Khoa học – Đại học Quốc gia Hà Nội; 01 bài đã đăng ở tạp chí Công nghệ Sinh học; 02 bài đã đăng ở tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên; 01 bài được đăng ở tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học – Hội Khoa học kỹ thuật phân tích Hóa, Lý và Sinh học Việt Nam, 01 bài báo quốc tế thuộc danh mục ISI được chấp nhận đăng.

1. Hoàng Thị Thu Yến, Mai Thị Huyền Trang, Phạm Thị Hằng, Huỳnh Thị Thu Huệ (2017), “Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa flavonol synthase từ chè Trung Du Thái Nguyên", Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, ISSN: 2588-1140, 33(04), tr. 127-136.
2. Hoàng Thị Thu Yến, Dương Trung Thành, Phạm Thị Hằng, Dương Trung Dũng, Huỳnh Thị Thu Huệ (2018),“Phân lập và mô tả trình tự gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase, anthocyanidin reductase từ chè Trung Du xanh Thái Nguyên (Camellia sinensis)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, ISSN: 1811-4989, 16(03), tr. 473-480.
3. Hoàng Thị Thu Yến, Huỳnh Thị Thu Huệ (2018), "Biểu hiện gen mã hóa leucoanthocyanidin reductase phân lập từ chè trung Du xanh (Camellia sinensis macrophylla) trong vi khuẩn E. coli", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, ISSN: 1859-2172, 187(11), tr. 129-135.
4. Hoàng Thị Kim Vân, Hoàng Thị Lý, Trần Thị Hằng, Mặc Đình Thiết, Nguyễn Thị Lan Anh, Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Thanh Huyền, Nguyễn Duy Khánh, Nguyễn Thị Thu Minh, Nguyễn Hải Đăng (2019), “Phân tích và đánh giá hàm lượng các hợp chất catechin từ lá chè xanh bằng LC/MS”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Hội Khoa học kỹ thuật phân tích hóa, lý và Sinh học Việt Nam, ISSN: 0868-3224, 24(03), tr. 55-59.
5. Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Thị Yến, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Hải Đăng (2019), “Tối ưu biểu hiện CsLAR1 tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli Rosetta và phân tích hoạt tính”, tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, ISSN: 1859-2172, 202(09), tr. 37-44.
6. Hoang Thi Thu Yen, Luu Han Ly, Nguyen Thuy Linh, Duong Trung Dung, Nguyen Hai Dang, Huynh Thi Thu Hue (2019), “A comparison of the production of polyphenol contentsand the expression of genes involved in Vietnamese tea cultivars”, International Food Research Journal, chấp nhận đăng.

- Sản phẩm đào tạo: 01 đề tài NCKH sinh viên, 01 khóa luận tốt nghiệp Đại học và 03 học viên cao học đã bảo vệ thành công luận văn.

1. Mai Thị Huyền Trang (2016), Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại hoc Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
2. Dương Trung Thành (2018), Nhân dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa anthocyanidin reductase của cây chè (Camellia sinensis), Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại hoc Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
3. Phạm Thị Hằng (2018), Tạo dòng và phân tích trình tự gen mã leucoanthocyanidin reductase từ cây chè (Camellia sinensis), Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại hoc Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
4. Dương Thị Hiền (2016), Tạo dòng và xác định trình tự một số đoạn cDNA/EST từ lá chè trồng tại Thái Nguyên, đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, Trường Đại hoc Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
5. Dương Thị Hiền (2017), Xác định một số đoạn trình tự cDNA từ lá chè Trung Du, Khóa luận tốt nghiệp Đại học, Trường Đại hoc Khoa học, Đại học Thái Nguyên.

- Sản phẩm ứng dụng: Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở nghiên cứu làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc quy định chức năng của một số gen liên quan đến tổng hợp polyphenol nói riêng và thành phần hóa học ở cây chè nói riêng.

6. Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu

Đề tài được thực hiện góp phần vào đào tạo sinh viên và học viên sau đại học của Trường Đại hoc khoa học - Đại học Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu của đề tài là thông tin khoa học hữu ích cho sinh viên, học viên cao học học tập, nghiên cứu và là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu làm sáng tỏ mối liên quan giữa thành phần hợp chất polyphenol và sự biểu hiện của các gen liên quan ở mức độ phân tử.

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information

• Project title: Researching construction of the cDNA/EST library, decode and analyze the expression of genes involved in polyphenol synthesis in growing tea in Thai Nguyen.
• Code number: B2016-TNA-24
• Coordinator: Dr. Hoang Thi Thu Yen
• Implementing institution: Thai Nguyen University
• Duration: from 01/2016 to 06/2018

2. Objective(s)

Studying construction the of cDNA/EST library, gene cloning and expression related in the pathway of polyphenol biosynthesis, quantification of some polyphenols from bud and young leaves of tea to elucidate expression of tea genes and contribute reseaching on the application of important compounds in tea.

3. New and innovative

The research team was the first people in Vietnam to carry out the construction of the cDNA/EST library, describing the structure, function and expression quantification of some of the genes related in the pathway of polyphenol biosynthetic inindigenous Trung Du tea in Thai Nguyen.

4. Research results

1. Five catechin compounds (C, GC, ECG, EGC, and EGCG) were quantified from eight tea samples, in which Indo tea samples had a highest total and constituent catechins. Khuc Van Tien and Trung Du Xanh have the similar catechins. PH1 tea sample has the lowest total catechin.
2. Quantify the expression of the FLS gene associated with flavonol synthesis; LAR and ANR genes are involved in the synthesis of catechins in both Trung Du Xanh and Trung Du Tim teas. The FLS, ANR and LAR genes expressed higher levels in Trung Du Xanh tea.
3. Studying the cDNA/EST library from three tea samples: Trung Du Xanh, Trung Du Tim and Phuc Van Tien. Results were obtained with 554 cDNA/EST clones. 158 clones contained insert fragment > 200bp. 92 clones were sequenced and obtained 18 homologous protein and 11 unspecified sequences on Genbank.
4. Cloning and analyzing FLS gene sequence from Trung Du Xanh tea and Trung Du Tim tea. The FLS gene length is 996 bp, encoding 331 amino acids. Amino acid content of FLS from the two tea samples have 97.9% homogeneous Coefficient. The CsANR2 and CsLAR1 genes were cloned from the Trung Du Xanh. CsANR2 gene length is 1.014 bp, coding 337 amino acids. The CsLAR1 cDNA is 1.029 bp, encoding 342 amino acids. Comparative results indicate that there is no amino acid sequence change in the key functional domains of CsANR2, in which CsFLS and CsLAR1 have some amino acid differences in domain and functional motifs compared to sequences on Genbank.
5. Expressing vector pET32a(+)_{_}FLS, CsANR2 and CsARAR1 gene was isolated from the Trung  Du Xanh tea. Recombinant FLS and CsLAR1 were expressed in E. coli Rosetta, recombinant CsLAR1 exhibits biological activity.

6. Products

- Science products: five articles were published, 1 in the journal of scienes – Viet Nam National University; Ha Noi (VNU), 1 in the journal of biotechnology and the two other articles were in the Journal of Science and Technology – TNU. 01 article was publised in the journal of analytical sciences – VietNam analytical sciences society, 01 international article belong to ISI list is accepted.

1. Hoang Thi Thu Yen, Mai Thi Huyen Trang, Pham Thi Hang, Huynh Thi Thu Hue (2017), “Cloning and sequence analysis of gene encoding flavonol synthase from Trung Du teas growing in Thai Nguyen", Journal of sciences, VietNam national university, Ha Noi, ISSN: 2588-1140, 33(04), pp. 127-136.
2. Hoang Thi Thu Yen,Duong Trung Thanh, Pham Thi Hang, Duong Trung Dung, Huynh Thi Thu Hue (2018),“Isolation and characterization of genes encoding leucoanthocyanidin reductase, anthocyanidin reductase from green Trung Du Xanh and Trung Du Tim (Camellia sinensis)”, Journal of biotechnology, ISSN: 1811-4989, 16(03), pp. 473-480.
3. Hoang Thi Thu Yen, Huynh Thi Thu Hue (2018), “Expression of gene encoding leucoanthocyanidin reductase isolated from green trung du tea (Camellia sinensis macrophylla) in E. coli", Journal of Science and Technology – TNU, ISSN: 1859-2172, 187(11), pp. 129-135.
4. Hoang Thi Kim Van, Hoang Thi Ly, Tran Thi Hang, Mac Đinh Thiet, Nguyen Thi Lan Anh, Hoang Thi Thu Yen, Nguyen Thanh Huyen, Nguyen Duy Khanh, Nguyen Thi Thu Minh, Nguyen Hai Dang (2018), “Analysis of catechin component in tea leaf byBY LC/MS”, Journal of analytical sciences – VietNam analytical sciences society, ISSN: 0868-3224, 24(03), pp. 55-59.
5. Hoang Thi Thu Yen, Nguyen Thi Yen, Huynh Thi Thu Hue Nguyen Hai Dang (2019), “Optimization of recombinant CsLAR1 in E. coli Rosetta and activity analysis”, Journal of Science and Technology – TNU, ISSN: 1859-2172, 202(09), pp. 37-44.
6. Hoang Thi Thu Yen, Luu Han Ly, Nguyen Thuy Linh, Duong Trung Dung, Nguyen Hai Dang, Huynh Thi Thu Hue (2019), “A comparison of the production of polyphenol contentsand the expression of genes involved in Vietnamese tea cultivars, International Food Research Journal, accepted.

- Traning products: successfully support for 01 scientific research project, 01 thesis of Bachelor graduation, 03 master thesises.

1. Mai Thi Huyen Trang (2016), Analysis gene sequence encoding Flavonol synthase from indigenous teainThai Nguyen, Master Thesis, University of sciences, TNU.
2. Duong Trung Thanh (2018), Cloning and designing expression vector of gene encodinganthocyanidin reductase from tea (Camellia sinensis), Master Thesis, University of sciences, TNU.
3. Pham Thi Hang (2018), Cloning and sequence analysis gene encoding leucoanthocyanidin reductase from tea (Camellia sinensis), Master Thesis, University of sciences, TNU.
4. Duong Thi Hien (2016), Cloning and sequencing some cDNA/EST from tea leaf growing in Thai Nguyen, student’s scientific research project, University of sciences, TNU.
5. Duong Thi Hien (2017), Sequencing some cDNA fragmentsfrom leaf of Trung Du tea, Bachelor Thesis, University of sciences, TNU.

- Application result: The research results of the projectare the basis for studying structure and the function of some genes involved in polyphenol synthesis and the chemical composition of tea plant.

6. Application capability and transfer of researching results

The project contributed training of students and graduate students in University of Sciences - Thai Nguyen University. The research results of the project are useful scientific information for students, graduate students studying and researching as well as scientific basis for further study to clarify the relationship between polyphenol compounds and the expression of the related genes at the molecular level.