Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài KH&CN cấp Bộ mã số B2017-TNA-48 do PGS.TS. Lưu Thị Bình - Trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên chủ nhiệm

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung

• Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của All trans retinoic acid lên các con đường tín hiệu phân tử của tế bào gốc ung thư dạ dày.
• Mã số đề tài: B2017 – TNA – 48
• Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lưu Thị Bình
• Tổ chức chủ trì: Đại học Thái Nguyên
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2017 – tháng 12/2018.

2. Mục tiêu

• Nuôi cấy thành công tế bào gốc ung thư dạ dày từ các dòng tế bào ung thư trong điều kiện môi trường nuôi cấy không có huyết thanh bò.
• Đánh giá khả năng áp chế sự hình thành các khối cầu in vitro (tumorsphere) của tế bào gốc ung thư dạ dày.
• Chỉ ra được tác động của acid retinoic lên sự biểu hiện gen trong các con đường tín hiệu phân tử khác nhau của tế bào gốc ung thư dạ dày.

3. Tính mới và tính sáng tạo

Retinoic acid được chỉ ra là chất dùng trong điều trị ung thư bạch cầu. Gần đây, chúng tôi đã chứng minh nó có khả năng ức chế ung thư dạ dày trong điều kiện nuôi cấy in vitro và cả trong chuột cấy ghép khối u. Tuy nhiên, ảnh hưởng của All trans retinoic acid (ATRA) lên các con đường tín hiệu phân tử của của tế bào gốc ung thư dạ dày vẫn còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, kết quả của đề tài này góp phần làm rõ cơ chế phân tử của sự ức chế ung thư dạ dày của all trans retinoic acid.

4. Kết quả nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu này đã thu được các kết quả chính như sau:

1. Nuôi cấy tế bào gốc ung thư dạ dày và xử lý tế bào với ATRA trong điều kiện nuôi cấy 3D: Nuôi cấy tế bào gốc ung thư dạ dày được thực hiện trên bề mặt không bám dính và môi trường chứa các chất sinh trưởng FGF, EGF, insulin. Trong điều kiện nuôi cấy này các tế bào gốc ung thư đã tạo ra các khối cầu hay còn gọi là tumorsphere. Trong khi đó, các tế bào khác nhanh chóng chết đi sau một vài lần phân chia. Các tumorsphere sau 5 ngày nuôi cấy được xử lý với ATRA đã làm cho số lượng tumorsphere bị giảm về cả số lượng và kích thước của tumorsphere.
2. Kết quả tách chiết RNA tổng số từ các tumorsphere: Các tumorsphere được thu nhận và RNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp Trizol. Kết quả phân tích phổ hấp thụ huỳnh quang của mẫu RNA tổng số đã cho thấy RNA tổng số thu được có độ tinh sạch rất tốt, tất cả các chỉ số 260/280 thông số đều lớn hơn 1,9. Thêm vào đó, RNA của các mẫu thu được đều có nồng độ cao và được sử dụng để tổng hợp thành cDNA phục vụ cho phân tích Realtime PCR trong nghiên cứu tiếp theo.
3. Đánh giá tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu apoptosis: Xử lý các tumorphere bằng ATRA đã điều hòa giảm hàng loạt các gen chủ chốt trong con đường tín hiệu apopotis của tế bào. Trong đó, ATRA đã điều hòa giảm sự biểu hiện của nhóm gen ức chế apoptosis như AKT1, BAD, NUP62, BCL2, PIK3R2, MAPK1. Trái ngược lại, ATRA đã điều hòa tăng sự biểu hiện của nhóm gen có vai trò thúc đẩy apoptosis gồmCASP9, FOXO3, IL2, P53.
4. Đánh giá sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu EGF, con đường tín hiệu JAK/STAT: Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ATRA là một thuốc có khả năng ức chế sự biểu hiện của nhiều gen khác nhau trong con đường tín hiệu EGF, và JAK/STAT. Trong đó các gen chủ chốt như GAB2, NUP62 và RPS6KA5 bị giảm mức biểu hiện từ 1.5 – 2 lần so với đối chứng. Các gen còn lại GAB1, STAT1, STAT2, NUP62, SRC hầu như không có sự thay đổi về mức độ biểu hiện.
5. Đánh giá sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các các gen liên quan đến sự làm mới tế bào và các gen đặc trưng của tế bào gốc: ATRA đã điều hòa sự giảm mạnh biểu hiện của các gene kiểm soát sự làm mới tế bào trong đó mức độ biểu hiện của KLF4 giảm 2 lần, DNMT1 giảm 4 lần và SOX2 giảm 5 lần so với mẫu đối chứng. Trong 5 gene được phân tích, chỉ duy nhất sự biểu hiện LIN28A không có sự thay đổi khi bị tác động bởi ATRA. ATRA làm giảm 2 lần sự biểu hiện của các gene ITGB1, CD24 và giảm khoảng 3 lần đối với các gene CD90 và MUC1. Trong khi đó, mức độ biểu hiện BMI1 hầu như không thay đổi và mức độ biểu hiện của ATAXIN1 tăng đáng kể, xấp xỉ 1,8 lần khi so sánh các tế bào được xử lí so với các tế bào không được xử lí với ATRA.
6. Đánh giá sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen trong con đường lão hóa tế bào: ATRA đã ức chế sự phiên mã của các gene mã hóa cho cyclin từ 4 đến 5 lần so với mẫu đối chứng. Tương tự như vậy, mức độ biểu hiện của các gene mã hóa cho các protein ở điểm kiểm soát chu kì tế bào gồm CHEK1 và CHEK2 giảm từ 2,5 đến 3 lần. Đặc biệt, các gen mã hóa cho các protein chủ chốt của con đường lão hóa tế bào là p53, P21 và GADD45A được biểu hiện tăng 1,5, 2,5 và 4 lần so sánh với mẫu đối chứng.

5. Sản phẩm

5.1. Sản phẩm khoa học

1. Ngô Thu Hà, Lưu Thị Bình, Lê Thị Thanh Hương, Mai Văn Linh, Nguyễn Đắc Trung, Nguyễn Phú Hùng (2017), “Ảnh hưởng của all-trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen của con đường apoptosis của tế bào ung thư dạ dày”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,  33 (1S), tr. 138-143. DOI: 10.25073/2588-1140/vnunst.4540.
2. Mai Văn Linh, Ngô Thu Hà, Lê Thị Thanh Hương, Lưu Thị Bình, Nguyễn Phú Hùng (2017), “Tác động của all trans retinoic acid lên con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT trong tế bào gốc ung thư dạ dày”, Tạp chí Y học Việt Nam, 469 (Tháng 8-Số chuyên đề), tr. 156-158.
3. Lê Thị Thanh Hương, Lưu Thị Bình, Diệp Thị Hương Giang, Nguyễn Phú Hùng (2018), “All trans retinoic acid ức chế sự biểu hiện của các gen liên quan tới khả năng tự làm mới và con đường tín hiệu phân tử Notch của tế bào gốc ung thư dạ dày”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 34 (4), tr. 30-36. DOI: 10.25073/2588-1140/vnunst.4787.
4. Lưu Thị Bình, Lê Thị Thanh Hương, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Phú Hùng (2019), “All trans retinoic acid điều hòa biểu hiện gene của con đường tín hiệu lão hoá tế bào ở dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Đã phản biện xong, đăng trong quý 4.

5.2. Sản phẩm đào tạo

Đào tạo thạc sĩ:

1. Diệp Thị Hương Giang (2018), Nghiên cứu ảnh hưởng của All trans retinoic acid lên sự lão hóa tế bào ung thư dạ dày MKN45, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên (Đã bảo vệ thành công, xếp loại Xuất sắc).
2. Mai Văn Linh (2018), Nghiên cứu ảnh hưởng của All trans retinoic acid lên con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT trong tế bào ung thư dạ dày MKN45, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên (Đã có lịch nghiệm thu tháng 11 năm 2019).

3. Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu

• Đề tài thuộc lĩnh vực nghiên cứu cơ bản.
• Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu: Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ cơ chế phân tử của sự áp chế ung thư bởi ATRA. Bổ sung thêm bằng chứng chứng minh ATRA là chất tiềm năng trong điều trị ung thư dạ dày.

INFORMATION OF RESEARCH RESULTS

1. General information

• Project title: Study of the effect of All trans retinoic acid on gene expression in signaling pathways in gastric cancer stem cell
• Code number: B2017-TNA-48
• Coordinator: Assoc. Prof. Luu Thi Binh
• Implementing institution: Thai Nguyen University
• Duration: From January 2017- December 2018

2. Objectives

• Culture cancer stem cells from gastric cancer cell lines in cultural medium without fetal bovine serum.
• Assess the inhibition of the in vitro tumorsphere formation from gastric cancer stem cells.
• Indicate the effect of retinoic acid on gene expression in different molecular signaling pathways of gastric cancer stem cells.

3. Creativeness and innovativeness

Retinoic acid has been used in the treatment of leukemia. We have recently shown it has the ability to inhibit stomach cancer in vitro culture and in tumor transplant mice. However, effect of All trans retinoic acid (ATRA) on the molecular signaling pathways of gastric cancer stem cellsremains known. Therefore, the results of this project contribute to clarify the molecular mechanism of ATRA-mediated gastric cancer inhibition.

4. Researh results

1. Results of Gastric cancer stem cell (CSC) culture and CSC treatment with ATRA in 3D culture condition. Gastric cancer stem cell culture is performed on non-adhering surfaces and media containing FGF, EGF, insulin growth substances. In this culture, the cancer stem cells create tumorspheres. However, other cells quickly die after a few cell division under these conditions. Tumorspheres after 5 days of culture treated with ATRA resulted in a decrease in the number and size of tumorspheres.
2. Results of total RNA extraction from the tumorsphere: Total RNA was extracted from tumorspheres by Trizol method. Results of fluorescence absorption spectra of total RNA samples showed that the total RNA obtained has very good purity. All 260/280 parameters are greater than 1.9. In addition, the RNA of the samples collected was high in concentration and used to synthesize into cDNA for realtime PCR analysis in the next study. Treatment of tumorphere with ATRAdown-regulated a series of key genes in the cell apopotis signaling pathway. In particular, ATRA reduced the expression of apoptosis-inhibiting genes such as AKT1, BAD, NUP62, BCL2, PIK3R2, MAPK1. In contrast, ATRA down-regulated expression of genes that promotes apoptosis including CASP9, FOXO3, IL2, and P53.
3. Assess the impact of ATRA on the expression of genes in the apoptosis signaling pathway. Treatment of tumorphere with ATRA down-regulated a series of key gene in the apopotis signaling pathway in gastric cancer stem cells. In particular, ATRA decreased the expression of genes inhibiting apoptosis such as AKT1, BAD, NUP62, BCL2, PIK3R2, MAPK1. In contrast, ATRA modulated the expression of a genes that promotes apoptosis including CASP9, FOXO3, IL2, and P53.
4. Assess the impact of ATRA on the expression of genes in EGF signaling pathway, JAK / STAT signaling pathway: This study show that ATRA inhibited the expression of various genes in the EGF, and JAK / STAT signaling pathway.In which, key genes such as GAB2, NUP62 and RPS6KA5 were reduced expression levels from 1.5 to 2 times compared to the control. The remaining genes such as GAB1, STAT1, STAT2, NUP62, SRC were not almost changed in expression level.   
5. Assess the impact of ATRA on the expression of genes involved in cell renewal and stem cell markers: ATRA down regulated expression of genes that control cell renewal, in which the levelof KLF4 expression decreased by 2 times, DNMT1 decreased by 4 times and SOX2 decreased by 5 times compared to the control. Only LIN28A expression was not changedin expression level. ATRA reduced the expression of ITGB1 and CD24 genes by 2 times, and 3 times for the CD90 and MUC1 genes. However, BMI1 expression level was almost unchanged and ATAXIN1 expression level increased significantly, approximately 1.8 times compared to untreated cells.
6. 6./. Assess the impact of ATRA on the gene expression in senessence pathway: ATRA inhibited the transcription of genes encoding cyclins 4 to 5 times more than the control. Similarly, the expression level of the genes coding for cell cycle proteins including CHEK1 and CHEK2 decreased from 2.5 to 3 times. In particular, the genes encoding the key proteins of the cellular senessence pathway including p53, P21 and GADD45A expressed 1.5, 2.5 and 4 times in comparison with the control.

5. Products

5.1. Sicientific products

1. Ngo Thu Ha, Luu Thi Binh, Le Thi Thanh Huong, Mai Van Linh,  Nguyen Dac Trung, Nguyen Phu Hung (2017), “All-trans Retinoic Acid Effect on the Apoptosis Gene Expression of Gastric Cancer Cell”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 33 (1S), pp. 138-143, DOI: 10.25073/2588-1140/vnunst.4540
2. Mai Van Linh, Ngo Thu Ha, Le Thi Thanh Huong, Lưu Thi Binh, Nguyen Phu Hung (2018), “All-trans retinoic acid effects on the EGF and JAK/STAT signaling pathways in gastric cancer stem cells”, Journal of Vietnam medicine, 469, pp.156-158.
3. Le Thi Thanh Huong, Luu Thi Binh, Diep Thi Huong Giang, Nguyen Phu Hung (2017), “Inhibition of All-Trans Retinoic Acid on the Expression of the Genes Envoled in Self-Renewal and Notch Signaling Pathway in Gastric Cancer Cells”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 34 (4), pp.30-36. DOI doi: https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4787.
4. Luu Thi Binh, Le Thi Thanh Huong, Nguyen Trung Thanh, Nguyen Phu Hung (2019), “All trans retinoic acid regulates expression of genes invoved in cell senescence pathway in gastric cancer cell line MKN45”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, completed review, posted in Q4.

5.2. Training products

1. Diep Thi Huong Giang (2019), Study the effect of All trans retinoic acid on the senessence of gastric cancer cells MKN45, Master thesis of Applied Biology, Thai Nguyen university of sciences.
2. Mai Van Linh (2019), Study the effect of All trans retinoic acid on EGF and JAK/STAT signaling pathways in gastric cancer cell MKN45, Master thesis in Applied Biology, Thai Nguyen University of Sciences.

6. Transfer alternatives, application institution, impacts and benefits of research results

• This is a basic research project.
• Impact and benefits of the research results: These research results contribute to clarify the molecular mechanism of cancer suppression by ATRA. These are additional evidences to prove ATRA is a potential substance in the treatment of gastric cancer.